基因测序的原理(基因检测概念股)

2023-06-22 05:23分类：沪港通阅读：

近10年来，肠道微生物基因组成为生命科学研究领域的热点。然而，目前大部分相关研究，仍使用主流二代测序技术进行肠道微生物种功能解析，宏基因组的拼接质量仍然有较大提高空间，且菌株水平的功能差异分析等领域亟待新的突破。

不久前，我国首部生物经济的五年规划《“十四五”生物经济发展规划》发布。该规划明确指出，加快发展高通量基因测序技术，推动以单分子测序为标志的新一代测序技术创新。而近期，三代测序技术已引发整个行业的关注，不少企业正积极布局，将其作为二代测序技术的有效补充，在针对二代测序范围外的复杂基因突变类型进行测序方面寻求新的解决方案。

有鉴于此，中国科学院微生物研究所王军研究员课题组和中国科学院动物研究所宋默识研究员课题组合作，利用三代纳米孔测序技术解析了肠道宏基因组，建立了三代和二代测序数据混合组装和后续分析流程。该研究提高了宏基因组组装的质量，以及对结构变异的发现能力，发现了大量包括插入突变和基因倒位在内的结构变异对于菌株水平上基因功能的影响，并对噬菌体等系统进行了深度挖掘，这些都是将三代纳米孔测序技术用于肠道微生物研究后取得的新进展。该研究论文近日发表在《自然·通讯》杂志上。

两代测序技术联手探索肠道微生物

人类的肠道是细菌、真菌等微生物的家园，这些微生物被统称为肠道微生物群。科学家们现在已经收集了人类肠道中4600多种细菌的20万个基因组和1.7亿个蛋白质序列，并建立了数据库。

尽管科学家长期致力于这一领域的研究，但肠道菌群中的一些微生物种类在很长时间内不为人所知。据估计，人体内含有的微生物数量比人体细胞还多。在人类肠道中已经发现了共计4600余种细菌。有研究表明，这其中超过70%的被检测到的细菌还未在实验室中培养，它们在人体内的活性仍然未知。

“在人的肠道中，尤其是在直肠里，有非常丰富的微生物，个体数量超过人体细胞的3—10倍。虽然这些微生物种的基因组较小，但由于种类很多，其基因多样性比人高10—100倍。”王军告诉记者，肠道微生物群落形成了一个非常复杂的肠道环境，对其进行研究有助于了解肠道的状态和功能，从而更好地了解人体和疾病，指导胃肠道疾病的诊断和治疗。

宋默识表示，肠道微生物在人类代谢食物、抵御感染和应答药物等过程中起着非常重要的作用。肠道维持着人体的代谢平衡，很多食物会在肠道内最终降解成小分子最终代谢物。如果肠道微生物生态系统失衡，将导致代谢功能失调，造成胃肠道疾病。同时，一些肠道免疫性疾病（如炎症性肠炎）也与肠道微生物生态系统的免疫调节相关。因此，肠道微生物群一直是科学家们最关注的议题之一。

但受研究方法的限制，相关研究一直进展较慢。

“以前，相关研究依靠低通量的微生物群培养手段。但随着二代测序技术的发展，能够使我们以较高通量的方法去了解肠道微生物种。近年来，三代测序技术发展迅速，又弥补了二代测序技术的一些不足，两者相结合，为探索肠道微生物种提供了较好的方法条件。”王军说。

三代测序是二代测序的有益补充

王军向记者介绍，以纳米孔测序为代表的三代测序技术飞速发展，目前英国ONT测序和美国PacBio测序两种技术路线，都能够完成较长的DNA片段测序。

三代测序技术较二代测序技术有何不同？

对此，王军表示，二代测序技术是目前的主流测序方式，已广泛应用于疾病和癌症的研究，具有高通量的特点，但不足之处在于测出来的基因片段较短，对于复杂的基因组区域以及较大的结构变异的检测有一定的局限性。而三代测序技术则能够帮助研究者针对感兴趣的基因或区域进行高深度测序研究。目前，三代测序技术已被应用于疾病或癌症领域人类基因遗传标志物、融合基因、甲基化检测等研究中，方法主要有长片段PCR扩增、CRISPR/Cas9靶向捕获和液相探针捕获三类。

在研究中，王军课题组使用了二代测序与三代测序数据组装拼接的办法。“引入三代测序能够弥补二代测序‘序列短’这一不足。三代测序读出的长序列就像一个‘骨架’，能够让研究者知道二代测序读出来的短片段之间有什么对应关系，该怎样拼接，从而提高整体基因拼接序列的质量，提高对某个生物染色体的全面认识。”王军说。

在三代测序方法出现之前，研究者利用二代测序技术拼出大大小小的不同基因片段，但常常无法知道某些片段属于哪个菌种。王军表示，虽然存在一些计算方法使研究者可以依据峰段、频率去推断基因片段之间的关系，但由于缺乏直接证据，这一研究难题仍无法得到根本解决。

“三代测序技术改变了这一情况。将三代测序技术得出的数据与二代的进行混合拼接，就能够在很复杂的环境中几乎接近拼出一个细菌的单个基因组。”王军说。

三代测序技术未来还有更大发展空间

近年来，全球实验室都开始大规模应用三代测序技术。

“每一个新测序技术刚出来的时候一般都很贵，大家都觉得是在‘烧钱’做研究。”王军向记者介绍，尽管三代测序技术为精细探索基因功能提供了新的路径，但其经济性仍不高，“三代测序技术的单位测序数据成本比二代要高很多。每次测序非常贵，一次出来的数据量约为二代的1/10，有时甚至还不到二代的3%。数据量少的特性是由三代测序技术的原理决定的。”

在充斥着电解液的容器中，放置镶嵌有纳米孔蛋白的分子膜。在相关蛋白质和酶的辅助下，DNA分子以较为稳定的速度通过纳米孔，当纳米孔内被特定的核苷酸占据时，会对孔周围的电流产生扰动。通过记录DNA分子通过纳米孔过程中产生的电流信号情况，再将这一特异性的电信号序列利用算法软件翻译为核苷酸序列，这就是三代测序技术的基本操作原理。

“目前的工艺决定了三代测序技术测出的数据量偏少。”王军说，但其与二代测序技术相结合，能为建立更高质量的基因图谱作出贡献。

下一步，三代测序技术还有哪些发展空间？

在王军看来，开发序列信息解读算法是一个发展方向。如何精确地将新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术生成的原始电信号翻译为序列信息，是科学家们关注的重点，近年来也诞生了多种用于精确翻译电信号的相关工具。

同时，三代测序技术还能在甲基化检测等特殊领域发挥重要作用。三代测序技术能够检测DNA分子自身的物理化学特性，因此生物基因组上的修饰信息也可以在电信号中得到反应。DNA分子上的甲基化修饰具有非常强的细胞特异性和细胞周期特异性，对表观遗传学研究有着重要的意义。

“三代测序技术暂时取代不了二代测序技术，但在未来，它将成为测序技术不可缺少的组成部分，在甲基化检测等独特领域实现其重要价值。”王军说。

华夏时报（www.chinatimes.net.cn）记者王瑜于娜北京报道

近期，我国首部生物经济五年规划——《“十四五”生物经济发展规划》发布，这标志着生物经济成为了一种全新的经济形态。《规划》指出，要开展前沿生物技术创新，加快发展高通量基因测序技术，推动以单分子测序为标志的新一代测序技术创新，明确鼓励探索第三代测序技术，将其作为有效补充，为二代测序范围外的复杂基因突变类型寻求新的解决方案。

事实上，三代测序近年来热度颇高，已引发了整个行业的关注，不少企业正积极布局。在二代测序已成红海的当下，大家开始向三代测序寻求答案。那么，这条探索之路应该如何走？

6月8日晚，贝瑞基因董事长、总经理高扬博士，PacBio太平洋生物科技总经理吴应光，兴业证券大健康研究中心总经理、医药行业首席研究员孙媛媛，易凯资本合伙人李钢做客华夏大健康™会客厅，共同探讨了如何在生物经济时代抢滩三代测序等前沿话题。此次会客厅由华夏时报社总编辑助理、大健康新闻部主任陈岩鹏主持。

三代测序具有高成长性

陈岩鹏：

三代测序是贝瑞基因布局的重点，在这个领域贝瑞基因非常有前瞻性，早在2019年就宣布与美国知名三代测序企业PacBio太平洋生物科技就第三代测序仪的开发及临床推广达成长期合作，双方联合开发第三代测序平台。那么高董您认为，贝瑞基因是因循怎样的思路和规划在布局三代测序，未来临床转化的发力点又是什么？

高扬：

我们布局三代基因测序领域，实际上经过了长期调研。我想说明的是，一代、二代、三代测序技术，不像其他领域是向下兼容，而是各有技术特点，互为补充。贝瑞基因长期从事罕见病和基因病的诊断，在这个过程中我们发现，有些基因病用一代、二代测序得不到有效解决，更别说性价比。因此我们下定决心，希望用这个世界上最成熟、最稳定的三代测序技术为临床带来更多的诊断方法。

我们在三代测序的布局实际上是科研先行、硬件提速、产品落地的状态。三代测序在科研领域经过了很长时间的发展，有大量科研文献，在相关领域形成了技术层面的论证。贝瑞基因和PacBio研发的硬件平台，目前进入医疗器械注册临床试验阶段。在硬件基础上，我们开发了地中海贫血基因检测试剂盒，现在也进入了临床试验阶段。

我们观察到，中国临床市场对三代测序产品的接受程度非常高。未来我们不仅要研发优质的产品，也要为中国人带来性价比更适宜的产品，我们有信心做好相当体量的基因病患者的筛查和诊断。

陈岩鹏：

PacBio太平洋生物科技是高质量测序的先进供应商。高保真长读长的三代测序，技术层面有其独特优势，那么生物经济时代，对于技术创新有了高维度要求，吴总您认为三代测序技术层面将面临的最大难题是什么？

吴应光：

三代基因测序非常独特，它读的很长，读的很准，它不仅能够解决诊断的问题，将来还会参与解决治疗问题（如基因治疗）。

2003年，科学家公布了当时被称为完整的人类基因组序列，但其中有大约8%空白区域没有序列数据，这主要包括高度重复DNA片段的区域以及着丝粒等高GC含量的区域。

直到近20年后的2022年年4月，《科学》杂志连续发布6篇论文报告，公布了首个完整无间隙人类基因组序列，填补了近20年来缺失的“拼图”碎片，主要归功于三代测序技术的大幅发展。

三代测序技术也大幅提升了基因检测技术解决临床问题的能力，以罕见病诊断为例，常规的二代测序技术基本上只能够解释约33%的罕见病病例的致病机理，而PacBio与美国Children’s Hospital Mercy的合作揭示，PacBio的HiFi测序因为其SNV，Indel，SV，以及甲基化的出色表现，有望将这一百分比提升至67%。

陈岩鹏：

都说拥抱趋势才能赶上风口，作为二级市场的研究人士，孙总您如何看待三代测序整体市场在生物经济时代的发展趋势和特点？

孙媛媛：

我们投资领域确实非常关注三代基因测序，未来也会有更多的资本涌入这个赛道。从二级市场维度来看，我认为测序板块具有很强的成长性，是一个长坡厚雪的赛道。这个赛道的成长性主要来自两点，首先它具有宽广的边界，这决定了其有一个长期较大的发展空间；第二它属于密集创新，决定了它有较高的成长性和丰富的业态。未来一级市场也会有一大批测序项目涌进来，那时这个赛道会获得更高的关注度和资金支持。

目前，人类已经把测序的能力边界从核酸领域拓展到了蛋白质领域。从技术创新角度来看，作为测序中的新兴细分领域，单分子测序的技术创新性更强，技术迭代速度更快，这个领域下游的关注度也非常高，未来在测序这个成长赛道中，大有可为。

从全球来看，三代测序市场规模已达到200亿美金。而且目前三代测序仪的渗透率还仅在10%左右，我们认为未来渗透率还会进一步提高。未来若干年，全球测序行业还将保持年均20%的增长速度。此次贝瑞基因和PacBio太平洋生物科技合作的三代基因测序产品，是一个很好的临床转化的案例。

陈岩鹏：

目前三代基因测序炙手可热，未来市场上关于三代测序的投资并购也会越来越多，从专业的角度，李总，作为投资人的您觉得应该如何判断一个优质的三代测序企业标的？

李钢：

我接触基因测序的时间还是蛮长的，我认为，一代、二代、三代测序，不像是笔记本的芯片，新一代出来就会把上一代完全迭代掉。

其实一代测序在临床应用上仍然很多。比如一代测序过程细致，质控环节多，不容易污染，测序结果也很直观。如果对二代测序结果有疑问，很多时候还会跟一代测序结果去比对。一代测序在某一些场景下还是金标准。但是一代测序，有一个非常大的问题，就是耗时长、成本高，所以，后来二代测序慢慢崛起。第二代基因测序技术逐步走入大众视野，第二代基因测序技术以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的SOLiD技术为代表。第二代测序法首先要将DNA随机切割成小片段，然后在这些小片段分子的两端连接上接头（adapter）制成DNA测序文库。

与第一代测序仪的区别在于，第二代测序仪采用的是合成测序法，即边合成边测序，在通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列的同时，对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析，最后获得全序列的测序结果。测试速度快，成本低，并且保持了高准确性。当然二代测序仪也有其缺点，由于其将DNA切割成小片段后扩增读取的技术路线，测序的读长较短，而且在扩增过程中也会给测序带来各种误差。

第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：

第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物（Helicos）的SMS技术和美国太平洋生物（Pacific Bioscience）的SMRT技术。

第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。

三代测序的研发需要大量的资金支持。我做了统计，从2019年到今天，三年多的时间，规模以上的融资大概发生了24起，总额在120亿人民币上下，因此不管是从金额还是数量上，这三年里，三代基因测序领域的增长非常快。

测序仪国产化提速

陈岩鹏：

我们看到贝瑞基因正在和PacBio联合开发三代桌面测序仪，当下测序仪国产化的话题关注度很高，高董您觉得如何在生物经济时代进一步为测序仪的国产化提速？

高扬：

既然提到国产化，我认为前提是必须充分了解中国市场。

今年1月，我们与PacBio开始联合研发三代桌面测序仪。为什么要做这件事？因为中国的临床市场是多层次的，要用硬件、用适宜的试剂盒来满足多层次需求。我们经过调研得到一个结论：广大临床市场只需测序仪满足某几个固定方面的应用。比如，三代测序仪在临床主要是针对结构复杂的变异等，对测序量要求不大，但对测序质量、数据解读的直观性要求较高。另外，中国广大医院对于基因病的诊断能力依然在提高中，对桌面型测序仪有比较大的需求。等到三代桌面测序仪研发成功，会率先在中国市场以国产化的形式上市。

提升国产化进程，从贝瑞基因的策略来说，这个领域相对很新，临床转化上就全世界而言，我们都走在前列。我们选择最好的技术合作伙伴，定位研发适宜中国市场的硬件平台和试剂盒。只有满足中国临床需求，提升国产化的努力才会有回报。一旦满足了需求，三代基因测序市场，临床级别的增速将远远超过科研级别。希望未来在三代测序领域，我们能成为技术的开拓者、市场的推广者、硬件国产化的中坚力量、临床与患者之间的桥梁。

陈岩鹏：

从技术和应用的角度，吴总您认为三代测序仪未来的方向将是怎样，比如小而美是否会成为大潮流？

吴应光：

临床实践表明，三代测序可以提供一个更高的卫生经济学结果。就以贝瑞基因正在推进的第三代地中海贫血病基因检测为例，这是国内首个基于三代测序技术在临床应用的检测产品，到目前为止，我们的临床测试显示，检出率几乎是100%，有很多一代或者二代都无法检测到的变异，都是三代测序检测出来的。

二代三代并不是完全迭代或者替代的过程，我认为三代的技术不会停留在小而美的阶段，因为它确实可以提供更多的回答，提供更高的卫生经济价值，它势必会到主流的应用上。

陈岩鹏：

三代测序因其特点，被视为打开大门的新钥匙，那么在孙总您看来，三代测序会为整个行业带来怎样的“鲶鱼效应”？

孙媛媛：

目前已经能够看到“鲶鱼效应”。就全球测序将近200亿美金的市场里，下游发展的速度高于上游，按照最新的数据测算，下游在市场里大概占到了七成。在下游市场中，临床端的市场增速高于科研端，测序下游的应用场景非常多元，临床端除了大家比较熟悉生殖健康，还有肿瘤、罕见病、代谢免疫等。而三代测序的一个能力特点就是和很多细分领域都有比较好的匹配度。未来，三代测序在下游细分领域的渗透值得期待。

陈岩鹏：

近年来，三代测序的市场热度越来越高，行业也需要快速健康有序发展，李总您对政策层面有些怎样的建议？

李钢：

就监管政策而言，我觉得应该给这些科技属性的创新企业更宽松的环境。在对企业临床试验标准严格的基础上，给予企业在技术上、政策上甚至资金、上市等方面一定支持。

让技术更快地应用到临床

陈岩鹏：

随着三代测序的飞速发展和市场规模的不断扩大，大家认为自己的企业在这个过程中都分别扮演什么样的角色？

高扬：

三代基因测序领域，目前来说，从科研到临床转化是趋势。贝瑞基因是长期在这个基因测序领域的临床应用方面转化和布局的企业，我们非常希望能够抓住甚至是引领三代基因测序。

在临床转化的这个浪潮中，我们希望能够成为三代测序技术的开拓者、市场的推广者和硬件国产化的中坚力量。我们非常希望能够利用三代基因测序这个技术平台开发出大量的适宜中国市场的基因诊断和基因筛查的产品，贝瑞基因要做好临床和患者之间技术桥梁的这个角色。

吴应光：

PacBio从2019年推出高保真测序技术之后，我们的业务中心逐渐从传统的纯科研，特别是动植物领域转向人类医学健康领域。我认为，PacBio还有很多非常有价值的事情可以做。第一，现在人类基因组的相当多的参考基组或者各种数据、模型，基本上都还是建立在ngs二代测序的基础上的，随着完整人类参考基因组的建立，现在有很多类似于叫泛基因组，就是我们称作为疾病相关数据库的更新，会让我们下游的临床应用更加精准。第二，我觉得可以更多的参与到人类基因临床科研以及健康诊断行业中来，与贝瑞基因深度合作，能够让技术更快地应用到临床中。

孙媛媛：

从二级市场投研的角度，我们的使命是发掘优质的企业，跟优秀的企业一同成长，让企业的市场估值和企业价值匹配。

目前我们也拥有非常强大的团队，我们团队现在有20个人，团队里的博士也是在美国攻读相关测序专业。三代测序，是我们团队长期重点关注的方向，未来也希望可以承担企业和市场之间桥梁的作用，让更多的二级投资人去了解三代测序的潜力和价值。

李钢：

我们投行作为资本和实业企业中间的桥梁，拥有国内最大的医疗健康团队，有70多人，都是专注在医疗健康领域。大部分人有生物学、医学等专业背景。所以，我们希望借助我们对资本、对行业、对技术的熟悉，能够让资金、资本有效的实现配置，然后让这些有前景的技术、有发展潜力的公司得到尽快的发展壮大，为中国甚至全球的病患提供更多的新医疗技术和救治手段。

孙媛媛：

我们比较关注三代测序，下游的应用场景假设做一个排序，您觉得下一个场景会是哪些？

高扬：

三代测序首先是拿出来解决下游相对比较明确的一些基因病的筛查和诊断。未来的临床场景，我们是非常希望做到一个全基因病的筛查和未明确疾病的诊断。

吴应光：

除了讨论过的诊断外，我认为三代测序，在接下来的治疗，特别是基因治疗领域，还有相当大的前景。

陈岩鹏：

能否用一句话描述一下您心中三代测序技术的未来？您对它的最大的期待是什么？

高扬：

三代基因测序为我们基因行业打开一扇全新的大门，我非常期待三代基因测序为全行业的从业者带来一些新的思路、新的方法和新的答案。

吴应光：

因为三代测序是典型的单分子实时测序，所以它的速度其实非常之快，我们希望在这个领域能够进一步有所突破。